Lassen Sie uns heute über das Problem sprechen, das unzählige Forschungskollegen Kopfschmerzen verursacht hat - Western Blot (WB) Experiment. Dieses scheinbar einfache, aber voll von "Fallen" Experiment, warum lässt es uns immer immer wieder stolpern? Lassen Sie uns nun die Gründe für Misserfolge gemeinsam überprüfen.
I. Keine Bänder
Mögliche Gründe können umfassen:
- Antikörperprobleme: Der Antikörper kann unwirksam, unspezifisch oder nicht an das Zielprotein binden.
- Stichprobenprobleme: Die Stichprobe kann störende Substanzen enthalten, zu niedrig in Konzentration sein oder sich bereits verschlechtert haben.
- Elektrophoreseprobleme: Unangemessene Elektrophoresebedingungen wie Spannung, Zeit oder unsachgemäße Verwendung von Puffer.
- Übertragungsprobleme: Probleme während des Übertragungsprozesses, wie unangemessene Membranauswahl, Übertragungszeit oder Übertragungspuffer.
- Blockierungsprobleme: Die Blockierungslösung kann unangemessen sein oder die Blockierungszeit kann zu lang sein.
- Färbungsprobleme: Das Färbungsreagenz kann abgelaufen, unempfindlich oder nicht ordnungsgemäß verwendet werden.
Geräteprobleme: Die Ausrüstung kann nicht funktionieren oder nicht ordnungsgemäß kalibriert werden.
- Experimentelle Operationsprobleme: Der experimentelle Betrieb ist möglicherweise nicht standardisiert, wie z. B. unzureichendes Waschen oder ungleichmäßige Probenbeladung.
- Proteinmodifikationsprobleme: Das Zielprotein kann posttranslationale Modifikationen durchlaufen, die eine Antikörpererkennung verhindern.
- Probleme mit der Zielproteinexpression: Das Zielprotein kann eine sehr geringe Expression oder keine Expression in den nachgewiesenen Zellen oder Geweben aufweisen.
Ii. Hoher Hintergrund
Mögliche Gründe können umfassen:
- Hohe Antikörperkonzentration: Die Verwendung zu viel Antikörper kann die unspezifische Bindung erhöhen, was zu einem hohen Hintergrund führt.
- Antikörperqualitätsprobleme: Der Antikörper kann eine hohe unspezifische Bindung oder eine Kreuzreaktion mit anderen Proteinen aufweisen.
- Unzureichende Blockierung: Die Blockierungslösung kann nicht spezifische Bindungsstellen auf der Membran effektiv abdecken, was zu einem hohen Hintergrund führt.
- Membranprobleme: Die Membran kann eine schlechte Qualität oder Kontamination aufweisen, was zu einem hohen Hintergrund führt.
- Unvollständige Übertragung: Während des Übertragungsprozesses werden Proteine möglicherweise nicht vollständig auf die Membran übertragen, was zu einem hohen Hintergrund führt.
- Unzureichendes Waschen: Die Waschschritte entfernen nicht effektiv ungebundener Antikörper oder andere Verunreinigungen, was zu einem hohen Hintergrund führt.
- Färbungsreagenzprobleme: Das Färbungsreagenz kann zu empfindlich oder instabil sein, was zu einem hohen Hintergrund führt.
- Experimentelle Geräteprobleme: Die Geräte können Leckage oder Störungen aufweisen, was zu einem hohen Hintergrund führt.
- Proteinprobenprobleme: Die Probe kann eine große Menge störender Substanzen wie Proteinabbauprodukte oder andere Verunreinigungen enthalten.
- Experimentelle Betriebsprobleme: Der experimentelle Betrieb ist möglicherweise nicht standardisiert, wie z. B. längere Inkubationszeit oder hohe Temperatur.
III. Nichtspezifische Bänder oder falsche Proteinbändergrößen
Mögliche Gründe können umfassen:
- Zu viele Passagen von Zellen, was zu unterschiedlichen Proteinenexpressionsniveaus führt, was zu inkonsistenten Bandengrößen oder dem Vorhandensein mehrerer Banden führt.
- Proteinprobenabbau, was zu einem niedrigeren Proteinmolekulargewicht oder dem Vorhandensein mehrerer Banden führt.
- In vivo exprimierte Proteinproben können verschiedene Formen von Modifikationen wie Acetylierung, Methylierung, Alkylierung, Phosphorylierung und Glykosylierung aufweisen, was zu inkonsistenten Bandengrößen oder dem Vorhandensein mehrerer Banden führt.
- Das Zielprotein enthält mehrere Isoformen oder Spleißvarianten, was zu inkonsistenten Bandengrößen oder dem Vorhandensein mehrerer Banden führt.
